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苏电电气水处理网讯:1引言(Introduction 甲烷(CH4是仅次于CO2的第2种首要的温室气体.如何减排温室气体CH4成为了全球关注的核心.同时,生物脱氮是当前废水处理领域的研究热门.污水处理厂中通常通过硝化和反硝化实现生物脱氮,而目前城镇污水普遍存在C/N比低的题目,导致在反硝化历程中往往需要大量的外加碳源.而在污水处理厂的厌氧处理历程中会产生大量的甲烷,如能将这部分甲烷作为碳源进行利用,既削减了甲烷的排放,又节流了能源的消耗.反硝化型甲烷厌氧氧化反应(DenitrifyingAnaerobicMethaneOxidation,DAMO正是可以利用甲烷作为碳源完成反硝化脱氮的历程.DAMO历程是以甲烷为电子供体和唯一碳源,以硝酸盐或亚硝酸盐为电子受体的一种氧化还原反应.2006年,该历程在实验室中得以证实(Raghoebarsingetal.,2006.在自然界中,溶解于水中的甲烷首要靠甲烷氧化菌等通过生物感化得以消耗现已发现在淡水系统、湿地系统、近海海洋生态系统中(Deutzmannetal.,2011Lueskenetal.,2011Kojimaetal.,2012Wangetal.,2012Hanetal.,2013Shenetal.,2013Shenetal.,2014均有存在可以耦合甲烷厌氧氧化感化(AnaerobicOxidationofMethane,AOM和反硝化感化(Denitrification的DAMO(DenitrifyingAnaerobicMethaneOxidation,反硝化型甲烷厌氧氧化微生物.根据系统发育分析,研究者检测到的DAMO细菌隶属于NC10门细菌DAMO古菌则属于甲烷厌氧氧化古菌ANME-2(Raghoebarsingetal.,2006.2017年,Wang等(2017提出了侧流式、主流式两种DAMO反应应用于污水处理厂的设想. 目前污水处理厂进水多为低碳高氮性质,多种化工、制药废水及垃圾渗滤液等,都含有较高浓度的氨氮,而高浓度的氨氮会对活性污泥中的微生物起抑建造用(郑雄柳等,2014,并会影响系统微生物菌群布局.目前已有研究报道高浓度氨氮对活性污泥系统中硝化细菌、厌氧氨氧化细菌等微生物具有抑建造用(Zhouetal.,2011,但对DAMO微生物的影响及机理鲜见报道.如欲将DAMO工艺应用于废水生物脱氮,探明氨氮对该历程的影响显得尤为首要.因此,本文利用已经成功富集的以DAMO细菌为上风菌种的系统(以下简称DAMO细菌系统(楼菊青等,2016为研究对象,通太短期和长期试验,从宏观和微观两个层面,研究氨氮对DAMO历程脱氮性能、微生物菌群布局的影响,综合考察DAMO细菌对氨氮的应激性、耐受性,并探索其抑制机理.为促进对DAMO微生物脱氮机理的研究和完善DAMO理论的发展添砖加瓦,为该工艺向实际工程应用推进一步. 2试验材料与方法(Materialsandmethods 2.1材料 2.1.1试验系统 本文的试验系统是基于之前已成功富集的以DAMO细菌为上风菌种的混培物(楼菊青等,2016.所得混培物是以淡水河道(西溪河底泥、淡水湖泊(西湖底泥及水稻农田土壤的同化物为接种污泥,甲烷和亚硝酸盐为唯一碳氮源.至本试验止,系统已稳定运行1392d. 2.1.2试验装配 试验装配为特制的直径为7.5cm、高度为17cm的500mL厌氧反应器. 2.2试验方法2.2.1短期试验方法 ①不同浓度氨氮对DAMO细菌的影响：通过批式实验研究氨氮对以DAMO细菌为上风菌种系统(以下简称DAMO细菌系统的短期影响,设3个平行试验组和一个对照组,试验时长7d,氨氮浓度梯度分别为50、250、500、750、1000、1250、1500mg"dotL-1.每12h取3mL水样,利用0.22"mum微孔滤膜过滤落后行三氮(氨氮NH4+-N、硝态氮NO3--N、亚硝态氮NO2--N的测定.在最高氨氮梯度浓度试验后,取泥水同化液10mL进行扫描电镜分析实验.②不同pH体系下氨氮的影响：根据上述短期试验成果进行批式试验,选取750mg"dotL-1氨氮作为试验浓度.用0.1mol"dotL-1HCl或0.1mol"dotL-1NaOH分别将pH调节为6.5、6.8、7.0、7.5、7.85个浓度并利用pH计实时监控反应器内的pH值,使其保持在相应的范围内,每组试验持续7d.取样与测定同①.当T=27℃时,不同pH体系对应的FA浓度可由公式(1计较得到. (1 式中,cFA为FA的浓度(mg"dotL-1cNH4+为氨氮的浓度(mg"dotL-1T为温度(℃ 2.2.3长期试验方法 氨氮对DAMO细菌的长期影响试验以短期试验成果为依据,将长期试验分为连续的4个阶段,每个阶段7d,这4个阶段的氨氮浓度按照短期试验浓度依次递增(李媛,2014,浓度分别为500、750、1000、1250mg"dotL-1,在28d后取样进行高分子通量测序. 2.3分析方法2.3.1常规指标测定 NO3--N、NO2--N、NH4+-N测定方法参考《水和废水监测分析方法》第四版(魏复盛,2002. 2.3.2微生物微观形态布局分析 利用扫描电镜对微生物微观形态进行特性分析.在每个阶段的短期试验历程中,取10mL样品,在4000r"dotmin-1条件下离心5min,取上清液,样品处理后用扫描电子显微镜SEM(SU8010,Hitachi进行微生物微观形态的特性分析. 2.3.3微生物群落布局分析 提取长期试验前后污泥样品中的基因组DNA,储于-20℃以下,并利用高通量测序分析.利用上海申能博彩生物科技有限公司生产的3S柱离心式DNA抽提试剂盒进行样品DNA的提取利用特定PCR引物进行序列扩增,全部样本按照正式试验条件均进行3次反复实验参照电泳初步定量成果,将PCR产物用QuantiFluorTM-ST蓝色荧光定量系统(Promega公司进行检测定量,以后按照每个样本的测序量要求,进行相应比例的同化通过构建Miseq文库、Miseq测速对16SRNA序列进行测序区分样本后,采用RDPclassifier贝叶斯算法对97%相似水平的OUT代表序列进行分类学分析,与Silva数据库比对,并在门、纲、属3个水平统计每个样品的群落构成. 3成果与讨论(Resultsanddiscussion 3.1氨氮对DAMO细菌的短期影响 3.1.1氨氮对以DAMO细菌脱氮性能的影响 不同浓度梯度(50~950mg"dotL-1的氨氮对DAMO细菌的脱氮性能影响见图1.其中图1a表示不同浓度氨氮感化下,系统内亚硝酸氮的消耗曲线,图1b表示不同浓度下亚硝酸氮的消耗速率与对照组的比值,以v表示试验组亚硝酸氮的消耗速率,v0表示对照组亚硝酸氮的消耗速率.其中误差范围由标准偏差表示. 图1 图1不同浓度NH4+-N对DAMO细菌脱氮性能的影响(a.NO2--N消耗曲线,以N计b.试验组与对照组的比值 当控制pH实验条件为7.0时,通过公式(1计较可知FA=4.879mg"dotL-1,由图1可见,在一定范围内,DAMO细菌脱氮性能随着氨氮浓度的增加而下降.由图1a可知,在空缺对照组中,其亚硝酸盐初始浓度为30.19mg"dotL-1,7d均匀消耗速率为2.92mg"dotL-1"dotd-1.在50、250mg"dotL-1氨氮感化下,系统的亚硝酸氮的消耗速率分别为2.94mg"dotL-1"dotd-1和2.96mg"dotL-1"dotd-1.相比于对照组,消耗速率略有上升,但颠末单因素方差分析后可知,其p值为0.65,大于0.05,说明3组数据无明显性差异,从而表明在50、250mg"dotL-1氨氮感化下,系统的脱氮性能并未出现抑制或促进现象(故该两组数据未在图1a中表示.而当氨氮浓度增加至500mg"dotL-1时,7d均匀亚硝酸盐消耗速率下降为2.42mg"dotL-1"dotd-1,其消耗速率为对照组的82.71%.当氨氮浓度为750mg"dotL-1时,7d均匀消耗速率与对照组相比,下降了43.15%.当在1000mg"dotL-1氨氮抑制条件下,经7d的消耗后,消耗速率下降了56.20%.在1250mg"dotL-1氨氮抑制条件下,亚硝酸盐7d均匀消耗速率仅为对照组的27.27%.Dapena-Mora等的研究以为针对厌氧氨氧化细菌,氨氮的IC50为770mg"dotL-1,与本试验成果相近(Dapena-MoraA,2007,可见,DAMO细菌对高氨氮废水表现出较强的抗冲击负荷的能力.这有利于DAMO细菌系统在含高氨氮废水处理厂中的应用. 3.1.2不同pH条件下氨氮对以DAMO细菌为上风菌种系统的影响 根据3.1.1节的短期试验成果,选取750mg"dotL-1的氨氮浓度进行试验.当T=27℃,不同pH体系下,对应的FA的浓度可由公式(1计较得到,计较成果见表1. 图2为不同pH时,DAMO细菌系统受氨氮影响时的脱氮性能.以pH=7.0为对照组,各pH条件下脱氮速率与该条件下脱氮速率比值为纵坐标,得图2b,由图2可知,在碱性条件下(pH=7.0、7.5、8.0,同样为750mg"dotL-1的氨氮,随着pH升高,FA升高,脱氮速率下降,当pH=8.0时,其FA浓度为46.09mg"dotL-1,此时脱氮速率不到对照组的1/2,且对pH=7.0、7.5、8.0条件下所得3组数据进行单因素方差分析,其p值为9.93"times10-5,远小于0.01,说明这3组数据之间有极明显差异而在酸性条件下(pH=6.5、6.8、7.0,固然FA值随着pH值的升高而升高,但通过单因素方差分析发现脱氮速率与FA值并无明显性差异.这说明在碱性条件下,氨氮对系统的抑制效果与FA值有关,FA是限制性抑制因子,该成果与氨氮对其他微生物抑制的大多数研究成果相吻合(Anthonisen,1976在酸性条件下,抑制效果与FA的浓度无关,以为离子化氨氮应是真实的抑制因子.该成果与之前部分研究相吻合,当溶液呈酸性(pH<7.0时,厌氧氨氧化菌、甲烷菌、反硝化菌等微生物活性受到抑制甲烷菌(Lay,1997等的活性取决于离子化氨氮NH4+的浓度,而不是质子化氨氮FA的浓度. 图2 图2不同pH下NH4+-N对DAMO细菌系统内NO2-消耗情况及脱氮性能的影响(a.不同pH条件下NO2--N消耗曲线b.不同pH条件下NH4+-N对系统脱氮性能的影响 3.1.3氨氮对DAMO细菌系统的微观形态影响 在1500mg"dotL-1的氨氮抑制试验7d后,取污泥同化液10mL离心后,利用扫描电镜分别观察抑制前后的污泥布局与微生物微观形态特性,成果见图3.由图3可知,氨氮抑制试验之前,在SEM下的絮状污泥微观布局清楚可见,细菌外形多样,以菌胶团的形式聚合在一起,其中占主导地位的是球状菌和短杆状菌,丝状菌数目较少.菌的表面较为滑腻,附着有少量胞外聚合物(ExtracellularPolymericSubstances,EPS.具体联系污水宝或参见 图3 图3氨氮抑制前后DAMO细菌系统扫描电镜照片(a.氨氮抑制前,b.氨氮抑制后 经高浓度氨氮短期抑制后的污泥与抑制之前相比,布局变得疏松,丝状菌大量繁殖,球状菌和短杆状菌则大量削减,污泥出现了明显的膨胀现象.而污泥中的微生物出现了明显的皱缩现象,另外微生物表面还包裹着一层粘性物质.由于聚合物覆盖在微生物的表面,在情况与微生物胞膜之间形成一个缓冲层,这种缓冲层有助于保护细胞体免受有毒物质损害,从生物反馈机制上理解：在情况条件改变的情况下,微生物分泌大量EPS的行为可以回结为生物应激性的一种表现,从而能够最大程度地避免微生物细胞体受危。